FEP Protein Mutation
导言
蛋白质是生命体内最重要的分子之一，它们在生命体内扮演着各种不同的角色，包括催化化学反应、传递信号、支持细胞结构等。蛋白质的结构和功能通常由其氨基酸序列决定，而突变会改变氨基酸序列，从而影响蛋白质的结构和功能。热稳定性是蛋白质稳定性的重要指标之一，对于蛋白质的应用和工业生产都有很大的影响。因此，预测蛋白质突变后的热稳定性是非常重要的。
Hermite®平台的FEP Protein Mutation模块将自由能微扰理论、分子动力学模拟和高性能计算相结合，可以准确、快速地预测蛋白质突变后的热稳定性变化，帮助研究人员快速评估蛋白质突变对其热稳定性的影响，指导蛋白质结构和功能的设计和优化
在本教程中，我们将学习使用 Hermite® 平台的 FEP Protein Mutation 模块准确、快速地预测Tenascin（腱生蛋白）[1] 中多种氨基酸突变后的结合自由能变化 [2]，帮助研究人员快速评估蛋白质突变对其热稳定性的影响，指导蛋白质结构和功能的设计和优化。
1. 创建项目并导入结构
1.1 登录系统
1.2 创建项目
- 进入系统后，创建新项目“FEP Protein Mutation”
1.3 导入蛋白结构
- 左侧通用菜单栏 Menu → File→ Import Structure
- 点击Get PDB，输入1TEN文件，点击Import导入该蛋白结构
2. 体系准备
2.1 准备蛋白结构
2.1.1 Select Structure
- 左侧通用菜单栏Function → General → Protein Preparation
- Select Structure from 3D Workspace：在Structure Hierarchy中选中Protein，点击Ok
- 1TEN.pdb被加载到Protein Preparation参数设置面板，点击Next
2.1.2 Alternative Position：
- 选择默认的氨基酸位置，点击 Next
2.1.3 Select Polymer、Other Groups to Keep
- 选中A链蛋白和 A 链的水，并点击 Next
2.1.4 Select Missing Residues to Repair
- 选中A链Missing Residues
2.1.5 Prepared Settings
- 取消勾选“Energy Minimization”，不对晶体结构进行能量优化，其余参数保持默认
2.1.6 命名Job并提交任务
- Job Name命名为“1TEN_Prepare”，点击“Submit”提交任务
2.1.7 查看蛋白准备结果
- Protein Preparation计算任务一般在十几秒到几分钟内完成。任务完成后，通过点击Jobs，查看相应任务；
- 点击“show”按钮，将准备后的蛋白结构展示在3D Workspace内
3. 创建FEP Protein Mutation任务
3.1 入口
- 左侧通用菜单栏 Menu → Function → Binding Affinity Evaluation → FEP Protein Mutation
3.2 Select Prepared Protein From Project
- 选择 “1TEN_pdb_prepared” 作为准备后的蛋白结构，点击 OK
- 点击 OK 后，系统会自动检查输入的蛋白是否符合计算要求，状态为“Processing”
-
大约不到1分钟，系统会判断该蛋白为“Valid”状态
-
设置蛋白氨基酸的质子化状态，pH默认值为7.0，此处不修改，点击Next
3.3 Select Mutation Site
-
Chain ID：选择为“Chain A”
-
Residue Number：根据以下氨基酸突变列表输入残基序号（可在Sequencce Viwer中联动选择残基）
-
Mutation Site List：根据以下氨基酸突变列表选择要突变为的残基类型
-
突变设置完成后如下图所示，点击Next继续下一步操作
- 氨基酸突变信息列表：
| Residue Number | Wild Type | Mutation | ddG_Exp |
| 811 | V | A | 1.36 |
| 819 | A | G | 2.8 |
| 833 | I | A | 3.28 |
| 851 | L | A | 2.99 |
| 858 | Y | A | 1.38 |
| 858 | Y | G | 2.76 |
| 867 | T | S | 1.22 |
| 882 | S | A | 2.28 |
3.4 Mutation Pair List
-
根据氨基酸突变信息列表，手动输入氨基酸突变的自由能变化实验值。（将WT体系的实验自由能设置为0，根据实验自由能差，得到各个突变体的实验自由能数值）
-
点击Next，继续下一步
3.5 Setting
- 参数设置保持默认值，点击Submit提交任务
4. 结果分析
4.1 入口
- 左侧通用菜单栏Job → Job List，找到“Protein FEP Analysis”计算任务，点击 “Show”按钮
4.2 结果展示
-
系统自动弹出FEP Protein Analysis结果界面
-
绿框：可以分析各Pair计算过程的可靠性
- 红框：点击 “Correlation Plot”，选择“Correlation Plot of ΔG”分析实验值 ΔG 和计算值 ΔG 的相关性，RMSE 和 R²分别为0.92 kcal/mol 和0.73，相关性较好。
5. 参考文献
[1] Structure of a Fibronectin Type III Domain from Tenascin Phased by MAD Analysis of the Selenomethionyl Protein. SCIENCE. 6 Nov 1992. Vol 258, Issue 5084. pp. 987-991.
[2] 此教程中使用的氨基酸突变热稳定性实验数据来源于数据库：Stourac, J., Dubrava, J., Musil, M., Horackova, J., Damborsky, J., Mazurenko, S., Bednar, D., 2020: FireProt(DB): Database of Manually Curated Protein Stability Data. Nucleic Acids Research 49: D319-D324.