FEP Calculation
导言
随着自由能微扰（Free Energy Perturbation，FEP）理论和算法的不断发展，以及计算机性能的提升，FEP计算的准确性和实用性都得到了极大的提高。利用FEP计算来评估一系列结构相近的候选药物分子（Ligands）与靶蛋白（Protein）的亲和力（Affinity）的差异，能够快速验证药物设计人员的想法，提高研发效率，降低实验成本，在药物研发领域受到了广泛的关注和应用。
Uni-FEP是深势科技自研的FEP完整解决方案，它将自由能微扰理论、分子动力学、增强采样算法与高性能计算相结合，能够以化学精度高效评估受体与配体的结合亲和力，适用于先导化合物优化阶段。
KRAS癌基因第一个被发现的人类肿瘤基因，也是人类肿瘤中最常见的突变基因之一。KRAS蛋白错义突变会减少GTP水解，改变GDP和GTP的稳态平衡。在KRAS的基因突变中，以第12位的突变最为常见，其中最主要的是G12D、G12V、G13D这三种突变。KRAS蛋白表面平滑, 具有近乎球形的空间结构, 缺乏较深的疏水口袋, 阻碍了高亲和力抑制剂的识别，因此一直被业内认为是典型的难成药靶点 [1]。人类致力于KRAS的研究长达四十余年，直至近年，才有共价靶向KRAS-G12C突变亚型的药物上市 [2]，但靶向其他KRAS突变，如KRAS-G12D的药物仍然是研发的难点。因此，开发有效的KRAS-G12D抑制剂，有望成为癌症治疗的新策略。
在本教程中，您将学习使用Hermite的Uni-FEP 模块快速验证专利和文献中已有活性的7个化合物分子与KRAS-G12D突变体的结合能力 [3]，Uni-FEP 预测的结合自由能与实验亲和力相关性较高。
本教程中使用的蛋白结构文件：
本教程中使用的配体结构文件：
1. 创建项目并导入结构
1.1 登录系统
1.2 创建项目
- 进入系统后，创建新项目“KRAS FEP”
1.3 导入蛋白结构
- 左侧通用菜单栏 Menu → File→ Import Structure
- 点击Select Files，选择KRAS.pdb文件，点击Import导入该蛋白结构
2. 体系准备
2.1 Select Structure
- 左侧通用菜单栏Function → General → Protein Preparation
- Select Structure from 3D Workspace：在3D Workspace中选中Protein，点击Ok
- KRAS.pdb被加载到Protein Preparation参数设置面板，点击Next
2.2 Select Polymer、Other Groups to Keep：
- 选中A链蛋白，并点击 Next（此蛋白结构中无other groups）
2.3 Select Missing Residues to Repair
- 本案例中无Missing Residues
2.4 Prepared Settings
- 设置参数详见 2.2.5 中的图，取消勾选Energy Minimization选项
2.5 命名Job并提交任务
- Job Name命名为“KRAS Protein Prepare”，点击“Submmit”提交任务
2.6 查看蛋白准备结果
- Protein Preparation计算任务一般在十几秒到几分钟内完成。任务完成后，通过点击Jobs，查看相应任务；
- 点击“show”按钮，将准备后的蛋白结构展示在3D Workspace内
3. 创建FEP Calculation任务
3.1 入口
- 点击左侧通用菜单栏 Menu → Function → Binding Affinity Evaluation → FEP Calculation
3.2 Select a Prepared Protein From Project
- 选择 “KRAS_pdb_prepared” 作为准备后的蛋白结构，点击 OK
- 点击 OK 后，系统会自动检查输入的蛋白是否符合计算要求，状态为“Processing”
- 大约不到1分钟，系统会判断该蛋白为“Valid”状态，点击“Next”
3.3 Select Prepared Ligands From File
-
点击 “From File”；
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在本地文件夹中选中已经下载的7个化合物分子；
-
点击“打开”，导入配体结构。
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7个 配体结构将被载入 “Selected File”。系统会自动检查输入的Ligand是否符合计算要求，状态为“Processing”，随后，系统会判断该配体为“Valid”状态。
-
点击Next
3.4 Alignment
- 系统提示是否进行Ligands Alignment，点击Yes
- 选择用于Alignment的参考分子，本案例中选择化合物M6作为参考分子
-
点击Next，系统自动选中剩余的Ligands进行Alignment
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在本教程中，选择“Rigid Alignment”方法进行Alignment
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点击Do Alignment提交任务
- Alignment 计算结束后，系统自动显示 “Alignment Ligand Checklist” 列表，检查Alignment任务是否有误
- 点击Next，进行下一步
3.5 Build Network
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Build Network Seeting：
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本案例中，选择A-optimal作为优化微扰图的策略
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根据Ligands的数目，Number of Cycles自动设置为4
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其余参数保持默认，点击Build Network
- Build Network任务提交后，界面显示“Perturbation is running.”
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等待Perturbation任务计算完成后，系统自动弹出“Perturbation Map”界面
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注：若没有微扰图页面的弹出，可以检查下该网页是否被拦截。
3.6 修改Perturbation Map
- Pairs的“Select”状态修改为“Yes”，只显示连接的Pairs
- 删除 “Similarity Score” 低于0.7的 Pairs，即将对应 Pairs 的 “Select” 状态修改由“Yes” 改为 “No”
- 将 Pairs 的 “Select” 状态修改为“All”显示所有的Pairs，进行修改Perturbation Map
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基于FEP 计算时的建议，修改Perturbation Map：
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为减少FEP计算误差，建议计算的分子间Similarity Score应大于0.7
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为减少FEP计算误差，建议参与FEP计算的Pairs应形成热力学循环
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我们将Perturbation Map修改为以下形式：
- 点击Submit Calculation，进行FEP任务提交设置
3.7 FEP 参数设置和提交任务
- 检查用于计算的Pairs，无误点击Next
- FEP计算保持默认参数，设置Job Name为“KRAS FEP”，点击Submit提交任务
4. 结果分析
- 注：FEP Calculation完成之后，程序会基于FEP Calculation提交的 pairs自动完成 FEP analysis，所以在查看 Uni-FEP 计算结果时只需要点击 FEP Analysis查看结果即可。
4.1 入口
- 左侧通用菜单栏Job → Job List，找到“FEP Analysis”计算任务，点击 “Show”
4.2 结果展示
- 点击 “Node” 按钮，勾选 “Ligand Name、ΔG EXP、ΔG FEP 和 σ(ΔG FEP )” ，点击 “Apply” 将实验亲和力和计算亲和力数值显示出来
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- 点击 “Correlation Plot”，分析实验值 ΔG 和计算值 ΔG 的相关性，RMSE 和 R²分别为0.87 kcal/mol 和0.54，相关性较好。
- 点击 “Analysis Report”，分析各 Pairs 计算结果的可靠性
5. 总结
本案例以KRAS-G12D突变体为例，对活性已知的7个化合物分子进行了蛋白和小分子间的FEP计算。结果表明，对于KRAS-G12D突变体，Uni-FEP能够准确评估化合物与靶点的相对结合自由能，从而指导先导化合物的优化的工作。
6. 参考文献
[1] KRAS as a Therapeutic Target. Clin Cancer Res. (2015) 21 (8): 1797–1801.
[2] The clinical KRAS(G12C) inhibitor AMG 510 drives anti-tumour immunity. Nature. volume 575, pages 217–223 (2019)
[3] Identification of MRTX1133, a Noncovalent, Potent, and Selective KRAS(G12D) Inhibitor. J. Med. Chem. 2022, 65, 4, 3123–3133