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EM Structure Fitting

导言​

近年来，伴随着冷冻电镜显微镜（cryo Electron Microscopy，cryo-EM）技术在硬件和算法方面取得的一系列的突破，cryo-EM技术的适用性和结果分辨率得到了稳定改进，已成为结构生物学领域重要的研究工具。在对cryo-EM数据进行处理的流程中，利用重构的三维密度图对生物分子进行建模，并进一步优化原子坐标是十分重要的环节。 Hermite平台的EM Structure Fitting模块提供了基于cryo-EM密度图的全原子结构模型柔性搭建功能。借助Hermite平台友好的操作界面、优化的算法和灵活的云计算资源，您可以方便快速地获得与密度图相吻合的高质量cryo-EM分子结构模型。

7XXB为拟南芥生长素转运蛋白PIN3的晶体结构，本教程选用经由7XXB序列预测出的蛋白结构，和7XXB的电镜密度图，基于EM Structure Fitting模块对预测结构进行优化，优化前后的蛋白结构调用Protein Alignment模块进行分析比较。

本教程所需文件如下：

7XXB-Fold .pdb

7xxb_emd_33500.ccp4

1. EM Structure Fitting​

1.1 入口​

  • 左侧通用菜单栏Function → Structure Modeling → EM Structure Fitting

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  • 右侧出现EM Structure Fitting的操作框（红框内所示），整体界面如下：

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1.2 操作​

  • 在Import Density Map下点击Select File上传电镜密度图，上传完成后下方显示上传的文件（7xxb_emd_33500.ccp4），电镜密度图显示于3D Workspace窗口中；

  • 在Select Structure下点击Select File上传蛋白结构，上传完成后下方显示上传的文件（7XXB-Fold .pdb），蛋白结构显示于3D Workspace窗口中；

  • 勾选Do Alignment对输入的结构与电镜密度图进行比对；

  • 在"Job Name"处命名该任务为EM_7XXB。

  • 点击“Submit"提交任务。

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1.3 结果展示​

  • 左侧通用菜单栏Menu Job → 找到任务EM_7XXB → 点击Operation列中的Show显示该任务的结果，界面如图所示。
import_structureimport_structure
  • 结果显示在3D Workspace区域。通过点击右侧Ribbon图标可关闭蛋白 Ribbon 的显示。

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  • 根据蛋白残基的显色信息，可以看到该蛋白结构的置信度较高。

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2. Protein Alignment​

2.1 入口​

  • 左侧通用菜单栏Menu → Function → General → Protein Alignment。

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  • 右侧出现Protein Alignment的操作框（红框内所示），整体界面如下：

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2.2 操作​

2.2.1 EM Structure Fitting后的蛋白结构比对​

2.2.1.1 参考蛋白的导入​
  • 在同一个 project 中，点击左侧通用菜单栏File → Get PDB → 弹出的窗口输入PDB ID：7XXB → Import。

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  • 界面右侧出现的Protein Alignment操作窗口，首先导入参考蛋白结构：点击Select Structure，弹出Select Structure窗口 → 在Structure Hierarchy内选中7XXB蛋白结构 → Select Structure窗口点击OK。

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2.2.1.2 需比对蛋白的导入​
  • Next点击后进入比对蛋白的选择窗口，导入需要比对的蛋白结构：点击Select from Project，弹出Select from Project窗口 → 在Select from Project窗口中选择Result of EM_7XXB.pdb → 点击OK。

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2.2.1.3 参数设置​
  • Next点击后进入参数设置页面，Alignment Atoms选择Cα从而基于蛋白之间的α-碳原子进行比对。由于无特殊的比对需求，因此跳过Select Binding Site的参数设置。Job Name处将该任务命名为7XXB_EM_PA，点击Submit提交该任务。

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2.2.2 EM Structure Fitting前的蛋白结构比对​

  • 操作步骤同2.2.1（Select Prepared Alignment Proteins选择7XXB-Fold.pdb），任务命名为7XXB-Fold PA。

2.3 结果分析​

2.3.1 入口​

  • 左侧通用菜单栏Menu Job → 找到任务7XXB_EM_PA → 点击Operation列中的Show显示该任务的结果，界面如图所示。

  • 7XXB-Fold PA任务结果的查看同上。

import_structureimport_structure

2.3.2 结果比较​

  • 根据比较发现，EM Structure Fitting优化前的蛋白结构与其实验测得的晶体结构7XXB的结构偏差（RMSD）为2.56Å（上图），经过EM Structure Fitting优化后的蛋白结构与7XXB的结构偏差（RMSD）仅为0.61Å（下图），意味着EM Structure Fitting根据电镜密度图对蛋白初始结构的优化效果显著。

import_structure

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  • 3D workspce窗口显示蛋白比对的可视化结果，由图可以看出，原始输入的蛋白结构7XXB-Fold.pdb中含有无法准确预测的部分，而电镜密度图中未记录这部分的信息，因此在进行EM Structure Fitting后，该部分被略去。

  • 经过EM Structure Fitting优化后，蛋白结构与实验观测解析出的晶体结构能更好地叠合。

import_structure EM Structure Fitting优化前

import_structure EM Structure Fitting优化后