预测结合位点的水分子位置与稳定性
导言
随着结构生物学的快速发展，大量与疾病密切相关的蛋白结构得到解析，极大地促进了基于结构的药物设计（structure-based drug design，SBDD） 的发展。利用 SBDD 进行化合物的结构优化迭代， 已经在药物研发过程中发挥不可替代的重要作用。
水分子广泛存在于药物靶标蛋白中，对于药物与靶标蛋白相互作用具有重要贡献。在药物设计中，替换水分子、与水分子形成相互作用，是优化化合物结构的有效方法。近年来，涌现出一系列通过合理替换水分子，提高化合物的结合活性、增强化合物的选择性、改善其药动学性质的案例。
Trujillo[1]等人通过设计一列hH-PGDS抑制剂先导化合物（化合物 9, 11, 13, 14）探索了对两个关键水分子（文献中称之为primary water、auxiliary water，本教程中展示为water 1、water2）进行置换和替换后，化合物亲和力变化趋势的例子。Trujillo等人的实验结果结论：替换auxiliary water后，化合物11的活性与化合物9相比下降了2~3倍；而替换primary water后，化合物13、14的活性与化合物9相比则下降百倍。这表明 primary water 比 auxiliary water在热力学上更加稳定。
| 4个主要化合物结构与活性 |
|---|
 |
| 说明 | 3D展示 |
|---|---|
| 化合物9与hH-PGDS的共晶（PDB 4EE0）结合模式。在结合位点中，有两个发生氢键网络的水分子Water 1 和 Water 2。 |  |
| 化合物11 与hH-PGDS的共晶（PDB 4EDZ）结合模式。化合物11在化合物9的吡啶氮的邻位引入一个甲基来替换 water 2，活性下降3.5倍。 |  |
| 化合物13 与hH-PGDS的共晶（PDB 4EDY）结合模式。化合物13在化合物9将吡啶环氮替换为碳，并引入胺甲基替换 water 1，活性下降630倍。 |  |
| 化合物14 与hH-PGDS的共晶（PDB 4EC0）结合模式。化合物14在化合物9将吡啶环氮替换为碳，并引入羟甲基替换 water 1，活性下降360倍。 |  |
本教程旨在使用Aquasite重点考察water 1 和 water 2 两个关键水分子的位置预测准确性，并通过计算水分子的自由能差值来评估water 1 和 water 2 的稳定性和重要性，为药物分子设计提供指导思路。
1. 建立项目并导入结构
1.1 登录系统
1.2 创建项目
进入系统后，创建新项目“hH-PGDS”
1.3 导入蛋白结构
| 操作 | 效果 |
|---|---|
| 选择 File→Get PDB |  |
| 输入4EE0，并导入该蛋白 |  |
2. 体系准备
2.1 手动准备体系
| 操作 | 效果 |
|---|---|
| 在 Structure Hierarchy 中： 1. 选择 “Protein” Chain A，删除； 2. 选择 “Ligand” A 004 202, A GSF 203, B GSF 202，删除； 3. 选择 “Others” Metal/Ions，删除 |  |
| 在 Structure Hierarchy 中，保留 B HOH 311、B HOH 322、B HOH 330、B HOH 337、B HOH 344、B HOH 353、B HOH 362、B HOH 372、B HOH 427、B HOH 430、B HOH 453，删除其余水分子。 |  |
| 删除后，Structure Hierarchy及蛋白结构右图： |  |
2.2 提取共晶ligand作为参考分子
| 操作 | 效果 |
|---|---|
| 将共晶 ligand B 0O4 201 “Extract to New Entry” |  |
| 并在 Entry lists重新命名为“Ligand” |  |
2.3 准备蛋白
2.3.1 Select Structure
| 操作 | 效果 |
|---|---|
| 选择 Function→Structure Modeling→Protein Preparation |  |
| Select Structure from 3D Workspace |  |
| 在Structure Hierarchy中选择 4EE0.pdb, 并在右侧 “Select Structure” 窗口中，点击 OK |  |
| 4EE0.pdb将加载到参数设置面板，点击Next |  |
| 操作 | 效果 |
|---|---|
| 2.3.2 Select Polymer、Other Groups to Keep 按照右图参数进行设置，并点击 Next |  |
| 2.3.3 Select Missing Residues to Repair 本案例中晶体结构不存在Missing Residues 2.3.4 Prepared Settings 按照下图参数设置参数 2.3.5 命名Job并提交任务 Job Name命名为“hH-PGDS-Protein Prepare”, 点击 Submmit 提交任务。 |  |
| 任务提交成功后，3D workspace会出现右图提示 |  |
| 2.3.6 计算任务查看 Protein Preparation的计算时间一般在十几秒到几分钟内完成。任务结束后，3D Workspace窗口会自动弹出消息如下消息栏。 |  |
| Tips 使用者可以通过Jobs，查看相应的任务，并点击“Show”将准备后的蛋白质结构展示在3D Workspace中。 |  |
| - |  |
3. Aquasite任务设置
3.1 Select a Prepared Protein From Project
| 操作 | 效果 |
|---|---|
| 选择 General→Aquasite |  |
| Select from Project |  |
| 选择 “4EE0_prepared” 作为准备后的受体结构，点击 OK |  |
| 点击 OK 后，系统会自动检查输入的蛋白是否符合计算要求，状态为“Processing”。 |  |
| 大约不到1分钟，系统会判断该蛋白为“Valid”状态。 点击“Next” |  |
3.2 Select a Prepared Reference Ligand
| 操作 | 效果 |
|---|---|
| 点击 “Select from 3D” |  |
| 在 “Structure Hierarchy”中选择 “Ligand” |  |
| 在“Select Ligands” 窗口中点击 OK |  |
| Ligand_B 0O4 201 将被载入 “Selected File”。系统会自动检查输入的Ligand是否符合计算要求，状态为“Processing”。 |  |
| 大约不到20秒，系统会判断该配体为“Valid”状态。 |  |
3.3 Confirm and Setting
| 操作 | 效果 |
|---|---|
| 勾选 “Calculate with Reference Ligand”选项，“Simulation Time” 修改为 10 ns，“Job Name” 设置为 “hH-PGDS-Aquasite”。 |  |
| 其余参数保持默认，点击“Submit”提交计算任务。 |  |
4. 结果分析
| 说明 | 展示 |
|---|---|
| 从右侧 Job 菜单中，打开Job List，找到“hH-PGDS-Aquasite”计算任务，点击 “Show”。 |  |
| 1. 调整3D Workspace的分子视角，重点展示小分子与预测水water 1（红色圈内的紫色分子），water 2（黄色圈内的紫色分子）， water3 （蓝色圈内的紫色分子）的位置与自由能。 2. 从右图结果中可以发现，预测water 1、2、3的位置与各自标记圈内的共晶水分子的位置几乎一致。这表明，Uni-Aquasite在预测结合水位置精确度方面相对准确。 3. water 1 的△G 为 -2.055 kJ/mol，water 2的△G 为0.981 kJ/mol。这表明：water 1 水分子比water 2 水分子更加稳定，更加重要；对此类水分子进行替换或置换可能会对化合物结合亲和力的影响很大。这与文献报道的结果一致。 |  |
5. 参考文献
Trujillo, John I., et al. "Investigation of the binding pocket of human hematopoietic prostaglandin (PG) D2 synthase (hH-PGDS): A tale of two waters." Bioorganic & medicinal chemistry letters 22.11 (2012): 3795-3799.